硫酸粘杆菌素最近EP标准((EP4.6)

定义：

          本品为特定的多粘芽孢菌变种粘杆菌素菌种制成或由其它方法获得的聚缩氨硫酸酸盐混合物。

含量：

          以干品计、Colistin E1,E2,E3各E1-I和E1-7MOA的总含量不低于77.0%。

          以干品计，Colistin E1-I不高于10.0%。

          以干品计，Colistin E1-7MOA不高于10.0%。

          以干品计，Colistin E3不高于10.0%。

性状：

          本品为白色或类白色粉末，有吸湿性，易溶于水，微溶于酒精，几乎不溶于丙酮和乙醚。

鉴别：

          首要鉴别法：B、E

          次要鉴别法：A、C、D、E

A　用薄层色谱法检查（2.2.27）

供试溶液：

          将5mg待检物质溶于1ml盐酸和水（等量混合）的混合液中，置于封闭管中于135℃下加热5小时。水浴中蒸发到干燥，继续加热至湿润的蓝色石蕊试纸不再变红。将残渣溶于0.5ml的水中。

          ● 参比溶液（a）：将20mg亮氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10ml。

          ●  参比溶液（b）：将20mg苏氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

          ● 参比溶液（a）：将20mg苯丙氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

          ● 参比溶液（d：）将20mg丝氨酸溶于水中，并用相同的溶剂稀释至10m。

          板：TLC硅胶G板

          流动相：水，苯酚（25：75V/V）

避光进行以下操作程序：

          点样：5ul点样成10mm带状

          将板置于色谱溶器中，使其不与流动相接触，注入蒸汽至少12小时。

          展开：展开超过12cm长,

          干燥：100~105℃烘干，

          检测：用茚三酮溶液喷涂，于100℃下加热5分钟。

          结果：供试溶液的色谱中显示出于参比溶液(a)和参比溶液(b)所得色谱相对应的区域，但没有显示出参比溶液(c)和(d)的区域，供试溶液中还显示了很低的RF值（2，4－二氨丁酸）。

          B　检查所得色谱的含量

          结果：在供试溶液的色谱中得到的ColistinE1和ColistinE2的峰的保留时间与在参比溶液（a）的色谱中对照的峰是相似的。

          C　将5mg溶解于3ml的水中，加入3ml稀氢氧化钠溶液，加入0.5mL10g/1的硫酸铜溶液，有紫色产生。

          D　将约50mg溶解于1mL1M的盐酸中，并加入0.5mL0.01M的碘，溶液颜色不变。

          E　本品显硫酸盐的特征反应。

测试：

PH：4.0~6.0

          溶解0.1g无二氧化碳的水中，并用相同的溶剂稀释至10ml。

比旋度：－63~－73（干品）

          溶解1.25g于水中，并用相同的溶剂稀释至25ml。

有关物质：

          液相色谱法（2.2.29），使用归一法。

供试溶液：

          将25.0mg样品溶于40ml的水中，并用乙腈稀释至50.0mL。

参比溶液（a）：

          将25.0mg的硫酸粘杆菌素CRS溶于40ml的水中，产用乙腈稀释至50.0 mL。

参比溶液（b）：

          用水和乙腈的混合液（20：80）稀释至1.0ml的参比溶液（a）至1.00ml。

柱子：

          ――――尺寸：L＝0.15m,φ=4.6mm

          ――――固定相：色谱用顶盖十八硅烷硅胶。

          ――――温度：30℃

流动相：22　溶积的乙腈和78溶积的以下述程序配制的溶液的混合液。

          将4.46g无水硫酸钠溶于900ml的水中，加入2.5ml的磷酸，然后用水（PH2.3~2.5）稀释到100ml。

流速：1.0ml/min

检测：215nm下分光光度计检测。

运行时间：ColistinE1保留时间的1.5倍。

          相对于ColistinE1（保留时间大约为16 min）的相对保留时间；

          ColistinE2大约为0.45，ColistinE3大约为0.5，ColistinE1-I大约为0.8，ColistinE1-7MOA大约为1.1。

系统适应性：参比溶液（a）:

          ――――分离度：在ColistinE3和ColistinE1之间的峰的分离不得低于8.0，在ColistinE2和ColistinE1-I之间的峰的分离不得低于6.0，在ColistinE1-I和ColistinE1之间的峰的分离不得低于2.5，在ColistinE1和ColistinE1-7MOA之间的峰的分离不得低于1.5。

          ――――所得的色谱应该与硫酸粘杆菌素CRS的相对应。

限度：

          ――――单杂：不高于4.0%。

          ――――总杂：不高于23.0%。

忽略限度：

          参比溶液（b）色谱中ColistinE1相应峰的而积，忽略ColistinE2，E3，E1和E1-7MOA相应的峰。

硫酸盐：

          以干品计，含16.0 %~18.0%的硫酸盐（SO4）。

          将0.250g溶解于100ml的水中，用浓氨将溶液的PH值调至11，加10.0mL0.1M的氯化钡和约0.5mg的酚酞紫。用0.1M的依地酸钠滴定，当溶液的颜色开始变化时加入50ML的酒精，继续滴定直到蓝色消失。

          1mL0。1M的氯化钡相当于9.606ml的硫酸盐（SO4）。

干燥失重：

          减失重量不得过3.5%，取本品1g，与60℃下用五氧化二磷干燥3小时，并保持压力不超过670Pa。

硫酸盐灰粉：

          取本品1.000g，灰粉不得过1.0%

含量：

          液相色谱法（2.2.29），如有关物质项下所述进行，做以下修改：

注射：供试溶液和参比溶液（a）

          用参比溶液（a）得到的色谱对照标准品（CRS）声明的含量来分别计算ColistinE2、E3、E1-I、E1和E1-7MOA百分含量的总和，E3的百分含量，E1-I的百分含量，E1-7MOA百分含量。

贮藏：密封，避光保存。